細胞培養實驗三要素

要素一、無菌實驗技術 

1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70% ethanol擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70% ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株的操作。 

2.無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流流通。實驗用品以75% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在臺面的中央無菌區域，勿在邊緣非無菌區域操作。 

3.小心取用無菌的實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 

4.工作人員應注意自身安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級的無菌操作臺（至少Class II）。操作過程中，應避免引起aerosol的產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭的傷害等。 

5. 定期檢測下列項目

5.1. CO₂ 鋼瓶的CO₂ 壓力。 

5.2. CO₂ 培養箱的CO₂ 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。

5.3. 無菌操作臺內的airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。 

6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

要素二、實驗用品 

1. 種類

1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。 

1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。 

1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml 

1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2種不同材質，其中polypropylene （PP） 為不透明材質，polystyrene （PS） 為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質的離心管。 

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。 

1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml 

2. 清洗

2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈后才開始使用。 

2.2. 用過的玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。 

3. 滅菌

3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。 

3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。   

3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121℃,15 lb,20 分鐘處理。

要素三、培養基 

1. 液體培養基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。 

2. 液體培養基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。 

3. 粉末培養基配制（以1 升為例）： 

3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清，因此粉末培養基的配制體積為900ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO₃ 為另外添加，若將NaHCO₃ 粉末直接加入液體培養基中會造成pH的誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO₃ 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。   

3.2. 材料

3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要） 

3.2.2. 粉末培養基 

3.2.3. NaHCO₃ （Sigma S-4019） 

3.2.4. 電磁攪拌器 

3.2.5. 無菌血清瓶 

3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 

3.2.7. pH meter 

3.2.8. 真空幫浦 

3.2.9. CO₂ 氣體

3.3. 步驟

3.3.1. 取粉末培養基溶于700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 

3.3.2. 稱取適量的NaHCO₃ 粉末（數量依培養基種類而異，表一）溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 

3.3.3. 將溶解且含飽和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解的液體培養基中混合。混后溶液的pH應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO₂氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH會升高0.1-0.2。 

3.3.4. 以0.1或0.2 mm無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。（血清亦可加入培養基中一起過濾） 

3.3.5. 配制的培養基配制須作生長試驗與污染測試。 

4. 配制培養基的生長測試 

4.1. 材料

4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish） 

4.1.3. methanol 

4.1.4. glacial acetic acid 

4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013） 

4.2. 步驟 

4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。 

4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落的生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 

4.2.3. 去除培養基，加入1ml Carnoy's 固定液（甲醇：冰醋酸 3:1），室溫下靜置10 min。 

4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 

4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。

4.2.6. 去除染液，水洗二次。

4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。